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http://repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/9143| Título : | ANÁLISIS DEL RNAm DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA ENZIMA ESCUALENO SINTASA (sqs) EN CULTIVO DE CÉLULAS DE Kalanchoe daigremontiana |
| Autor : | DR. JIMENEZ APARICIO, ANTONIO RUPERTO QFB. LÓPEZ DÍAZ, DULCE ESTHER |
| Palabras clave : | Kalanchoe daigremontiana bufadienolidos gen sqs |
| Fecha de publicación : | 12-nov-2010 |
| Resumen : | Introduction: Kalanchoe daigremontiana is a plant that exhibit medicinal properties thanks to the occurrence of bufadienolides. These secondary metabolites presents cytotoxic activity against different carcinogenic cellular lines. Bufadienolides belong to the triterpens group. Escualene sintase enzyme (SQS) plays an important role in biosynthesis and accumulation of bufadienolides. Nevertheless, the extraction and purification of such metabolites requires great quantities of vegetal material. However, it is necessary to develop a sustainable biotechnological system to get a viable alternative for the production of these metabolites. In this way, plant cell and tissue culture could be an important tool. Objective: The aim of present study was to analyze the expression of the gene that codify to SQS enzyme as well as to detect the presence of bufadienolides in non-differentiated in vitro cells of K. daigremontiana. Methodology. An in vitro cell culture of this plant was established using stem explants growing in a Murashige and Skoog (MS) medium added with a mixture of two phytoregulators: bencylaminopurine (BA 1mg/L) and 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D 0.5 mg/L). Duplication time and relative growth velocity were obtained from the callus growth kinetics. The molecular study was performed with a Northern blot analysis. The mRNA was extracted and quantified from root, leaf and callus of K. daigremontiana. The plasmid that contains the SQS gene (pBI121sqs) was obtained using a maxi-preparation protocol and purified by the kit GeneClean® II Kit Bio101. The heterologous probe was no-radioactive marked and hybridized. The detection was performed by a colorimetric reaction using the Biotin DecaLabelTM DNA Labeling kit. The obtaining of blue precipitate is characteristic of mRNA presence. Finally, bufadienolides were extracted with different polarity solvents and identified using thin layer chromatography and antimony trichloride as a specific revelator. Results: Green-light colored calluses were obtained at the tenth day of culture The kinetics data showed that callus growth presented a duplication time of 5.35 days and relative growth velocity of 0.187 d-1; also, four stages of callus development were observed: adaptation, exponential growth, stationary and death. From these data, four growing days were selected with the aim to detect the presence of bufadienolides as well as the expression of the gen (sqs) that codifies to SQS enzyme. Regarding the detection of bufadienolides using thin layer chromatography, these were found in all four stages of growing callus of K.daigremontiana. The results showed that the most remarkable stage was the stationary phase followed by the death phase. During adaptation and growing stages, both, precursors and bufadienolides were found. In the other hand, the expression of sqs gen was found in all stages. The mRNA of sqs gene was clearly detectable in both, stationary and death stages, while in the growing stage was found in low levels; in the adaptation stage, non-expression of the gen was detected. It is consider that these results are originals relating to the analysis of expression of the sqs gen and the detection of bufadienolides in in-vitro non-differentiated cell cultures of this plant. Finally the experimental evidences suggest that the expression of the gen sqs is closely related with the biosynthesis of bufadienolides. |
| Descripción : | Introducción: Kalanchoe daigremontiana es una planta que presenta propiedades medicinales, gracias a la presencia de bufadienólidos. Estos metabolitos secundarios presentan actividad citotóxica contra las diferentes líneas celulares cancerígenas. Los bufadienolidos pertenecen al grupo de triterpenos. La enzima Escualeno sintasa (SQS) desempeña un importante papel en la biosíntesis y acumulación de bufadienólidos. Sin embargo, la extracción y purificación de tales metabolitos requiere grandes cantidades de material vegetal. Por lo tanto, es necesario desarrollar un sistema biotecnológico sostenible para tener una alternativa viable para la producción de estos metabolitos. De esta manera, el cultivo de células y tejidos vegetales puede ser una herramienta importante. Objetivo: El objetivo del presente estudio fue analizar la expresión del gen que codifica para la enzima SQS, así como detectar la presencia de bufadienólidos en células no diferenciadas cultivadas in vitro de K. daigremontiana Metodología. Se estableció un cultivo de células in vitro de esta planta utilizando explantes creciendo en un medio Murashige y Skoog (MS) adicionado con una mezcla de dos fitorreguladores: bencilaminopurina (BA 1 mg / L) y ácido 2,4 – diclorofenoxiacético (2,4 – D 0,5 mg / L). El tiempo de duplicación y la velocidad relativa de crecimiento se obtuvieron de la cinética de crecimiento de los callos. El estudio molecular se realizó con un análisis tipo Northern blot. El mRNA se extrajo y cuantificó de. Raíz, hoja y callo de K. daigremontiana. El plásmido que contiene el gen de la SQS (pBI121sqs) se obtuvo mediante un protocolo de maxi-preparación y se purificó con el GeneClean ® II Kit Bio101. La sonda heteróloga fue marcada no radiactivamente; posteriormente se realizó la hibridación y se detectó a través de una reacción colorimétrica utilizando el kit Biotin DecaLabelTM DNA Labeling. La obtención de un precipitado azul fue característico de la presencia de mRNA. Por último, los bufadienólidos se extrajeron con disolventes de diferente polaridad y se identificaron mediante cromatografía de capa fina y tricloruro de antimonio como un revelador específico. Resultados: Se obtuvieron callos de color verde-claro en el décimo día del cultivo. La cinética mostró que el crecimiento de callos presentó un tiempo de duplicación de 5,35 días y la velocidad de crecimiento relativo de 0.187 d-1; también, cuatro etapas de desarrollo de callos se observaron: adaptación, el crecimiento exponencial, estacionaria y muerte. A partir de estos datos, cuatro días de crecimiento fueron seleccionados con el objetivo de detectar la presencia de bufadienólidos, así como la expresión del gen (sqs) que codifica para la enzima SQS. En cuanto a la detección de bufadienólidos usando la cromatografía de capa fina, éstos fueron encontrados en las cuatro etapas del crecimiento de callos de K.daigremontiana. Los resultados mostraron que la etapa más notable fue la fase estacionaria seguida de la fase de muerte. Durante las etapas de adaptación y crecimiento, se encontraron los precursores y bufadienolides. Por otro lado, la expresión del gen sqs se encontró en todas las etapas. El mRNA del gen sqs fue claramente perceptible tanto en la fase estacionaria como la de muerte, mientras que en la etapa de crecimiento se encontró en niveles bajos; en la etapa de adaptación, la expresión del gen no se detectó. Se considera que estos resultados son originales relacionados con el análisis de la expresión del gen sqs y la detección de bufadienólidos en cultivos in vitro de células no diferenciadas de esta planta. Finalmente, las evidencias experimentales sugieren que la expresión del gen sqs está estrechamente relacionada con la biosíntesis de bufadienólidos. |
| URI : | http://www.repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/9143 |
| Aparece en las colecciones: | Mediateca |
| Fichero | Descripción | Tamaño | Formato | |
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| Tesis de Meaestria Dulce Esther López Díaz CeProBi 2011 Bole.pdf | ANÁLISIS DEL RNAm DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA ENZIMA ESCUALENO SINTASA (sqs) EN CULTIVO DE CÉLULAS DE Kalanchoe daigremontiana | 2.54 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |
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